Rekombinantni protein: metode pripreme i primjene

Proteini su važna komponenta svih organizama. Svaki od njegovih molekula sastoji se od jednog ili više polipeptidnih lanaca koji se sastoje od aminokiselina. Iako su informacije neophodne za život kodirane DNK ili RNK, rekombinantni proteini obavljaju širok spektar bioloških funkcije u organizmima, uključujući enzimsku katalizu, zaštitu, podršku, kretanje i regulaciju. Prema funkcijama u organizmu, ove supstance se mogu podeliti u različite kategorije, kao što su antitela, enzimi, strukturna komponenta. S obzirom na važne funkcije, takva jedinjenja su intenzivno proučavana i široko korištena.

U prošlosti je glavni način dobijanja rekombinantnog proteina bila njegova izolacija od prirodnog izvora, koji je, po pravilu, neefikasan i dugotrajan. Nedavni napredak u molekularno biološkim tehnologijama omogućio je kloniranje DNK koja kodira određeni skup supstanci u vektor ekspresije supstanci kao što su bakterije, kvasac, ćelije insekata i ćelije sisara.

Jednostavno rečeno, rekombinantni proteini su prevedeni egzogenim DNK proizvodima u živim ćelijama. Njihova proizvodnja obično sadrži dve glavne faze:

1. Kloniranje molekula.
2. Ekspresija proteina.

Trenutno je proizvodnja takve strukture jedna od najmoćnijih metoda korištenih u medicini i biologiji. Sastav se široko koristi u istraživanju i biotehnologiji.

Medicinski pravac

Rekombinantni proteini pružaju važne tretmani za razne bolesti kao što su dijabetes, rak, zarazne bolesti, hemofilija i anemija. Uobičajene formulacije takvih supstanci uključuju antitijela, hormone, interleukine, enzime i antikoagulanse. Postoji sve veća potreba za rekombinantnim formulacijama za terapijsku upotrebu. Oni omogućavaju proširenje metoda liječenja.

rekombinantni proteini dobijeni genetskim inženjeringom igraju ključnu ulogu na tržištu terapijskih lijekova. Trenutno se većina terapijskih supstanci proizvodi u ćelijama sisara, jer je njihov sastav sposoban proizvesti visokokvalitetne supstance slične prirodnim. Pored toga, mnogi odobreni rekombinantni terapeutski proteini se proizvode u E. coli zbog dobre genetike, brzog rasta i visoko produktivne proizvodnje. Također ima pozitivan učinak u razvoju lijekova na bazi ove supstance.

Sprovođenje istraživanja

Proizvodnja rekombinantnih proteina zasniva se na različitim metodama. Supstance pomažu u otkrivanju osnovnih i osnovnih principa tijela. Ovi molekuli se mogu koristiti za identifikaciju i određivanje lokacije supstance kodirane određenim genom i za otkrivanje funkcija drugih gena u različitim ćelijskim aktivnostima, kao što su ćelijska signalizacija, metabolizam, rast, replikacija i smrt, transkripcija, translacija i modifikacija kompozicija razmatranih u članku.

Stoga se pregledani sastav često koristi u molekularnoj biologiji, ćelijskoj biologiji, biohemiji, strukturnim i biofizičkim istraživanjima i mnogim drugim poljima nauke. Istovremeno, proizvodnja rekombinantnih proteina ima međunarodnu praksu.

Takvi spojevi korisni su alati u razumijevanju međućelijskih interakcija. Oni su dokazali svoju efikasnost u nekoliko laboratorijskih metoda, kao što su ELISA i imunohistohemija (IHC). Rekombinantni proteini mogu se koristiti za razvoj enzimskih testova. Kada se koriste u kombinaciji sa parom odgovarajućih antitela, ćelije se mogu koristiti kao standardi za primenu novih tehnologija.

Biotehnologije

Rekombinantni proteini koji sadrže aminokiselinsku sekvencu se takođe koriste u industriji, proizvodnji hrane, poljoprivredi i bioinženjeringu. Na primer, u stočarstvu, enzimi se mogu dodati u hranu kako bi se povećala nutritivna vrednost sastojaka hrane, smanjili troškovi i otpad i podrška zdravlje od životinjskih crijeva, poboljšajte performanse i poboljšajte okruženje.

Osim toga, bakterije mliječne kiseline (LAB) se dugo koriste za proizvodnju fermentirane hrane, a nedavno je razvijena i laboratorija za ekspresiju rekombinantnih proteina koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja se može široko koristiti, na primjer, za poboljšanje ljudske probave, životinja i ishrane.

Međutim, takve tvari imaju i ograničenja:

1. U nekim slučajevima, proizvodnja rekombinantnih proteina je složena, skupa i dugotrajna.
2. Supstance proizvedene u ćelijama možda se ne podudaraju sa prirodnim oblicima. Ova razlika može smanjiti efikasnost terapijskih rekombinantnih proteina, pa čak i izazvati neželjene efekte. Pored toga, ova razlika može uticati na rezultate eksperimenata.
3. Glavni problem za sve rekombinantne lijekove je imunogenost. Svi biotehnološki lijekovi mogu pokazati neki oblik imunogenosti. Teško je predvidjeti sigurnost novih terapijskih proteina.

Općenito, napredak u biotehnologiji povećao se i olakšao proizvodnju rekombinantnih proteina za različite primjene. Iako još uvijek imaju neke nedostatke, tvari su važne u medicini, istraživanju i biotehnologiji.

Veza sa bolestima

rekombinantni protein ne nanosi nikakvu štetu ljudima. Ovo je samo sastavni dio zajedničkog molekula u razvoju određenog elementa lijeka ili hrane. Mnoge medicinske studije pokazale su da je prisilna ekspresija proteina FGFBP3 (skraćeno BP3) u laboratorijskom soju gojaznih miševa pokazala značajno smanjenje njihove masne mase, uprkos genetskoj predispoziciji za upotrebu.

Rezultati takvih eksperimenata pokazuju da protein FGFBP3 može ponuditi novu terapiju za uklanjanje poremećaja povezanih s metaboličkim sindromom, poput dijabetesa tipa 2 i gojaznosti jetre. Ali budući da je BP3 prirodni protein, a ne vještački lijek, klinička ispitivanja rekombinantnog humanog BP3 mogu početi nakon posljednje runde pretkliničkih studija. O, odnosno razlozima vezanim za sigurnost provođenja takvih studija. Rekombinantni protein također ne nanosi štetu ljudima zbog svoje korak-po-korak obrade i čišćenja. Promjene se dešavaju i na molekularnom nivou.

PD-L2, jedan od ključnih igrača imunoterapije, nominiran je za Nobelovu nagradu za fiziologiju ili medicinu 2018. godine. Ovaj posao je započeo profesor James P. Allison iz SAD-a i profesor Tasuku Honjo iz Japana, doveli su do liječenja karcinoma poput melanoma, raka pluća i drugih, na osnovu imunoterapije kontrolnih tačaka. Nedavno je AMSBIO svojoj liniji imunoterapije dodao važan novi proizvod - rekombinantnu ćelijsku liniju PD-L2/TCR-CHO aktivator.

U eksperimentima za testiranje koncepta, istraživači sa Univerziteta Alabama u Birminghamu predvođeni MD X.Long Dženg, Profesor Robert B. Adams i Direktor Odjela za laboratorijsku medicinu na odjelu za patologiju Medicinskog fakulteta UAB istakli su potencijalnu terapiju za rijedak, ali fatalan poremećaj zgrušavanja krvi, TTP.

. Rezultati ove studije po prvi put pokazuju da transfuzija trombocita napunjenih rADAMTS13 može biti novi i potencijalno efikasan terapeutski pristup arterijskoj trombozi povezanoj sa kongenitalnim i imuno posredovanim TTP-om.

Rekombinantni protein nije samo nutrijent, već i lijek u sastavu lijeka koji se razvija. Ovo su samo neke od oblasti koje se trenutno bave medicinom i odnose se na proučavanje svih njenih strukturnih elemenata. Kao što pokazuje međunarodna praksa, struktura supstance omogućava rješavanje mnogih ozbiljnih problema u ljudskom tijelu na molekularnom nivou.

Razvoj vakcine

Rekombinantni protein je specifičan skup molekula koji se mogu modelirati. Slična imovina se koristi u razvoju vakcina. Nova strategija vakcinacije, poznata i kao upotreba posebne rekombinantne virusne injekcije, mogla bi pružiti zaštitu milionima pilića u opasnosti od ozbiljne respiratorne bolesti, izvijestili su istraživači sa Univerziteta u Edinburgu i Instituta Pirbright. Ove vakcine koriste bezopasne ili slabe verzije virusa ili bakterije za ubrizgajte mikrobe u ćelije tijela. U ovom slučaju, Stručnjaci su koristili rekombinantne viruse s različitim proteinima šiljaka kao vakcine za stvaranje dvije verzije bezopasnog virusa. Postoji mnogo različitih lijekovi mrežne konekcije.

Rekombinantni protein ima sljedeće trgovačke nazive i analoge:

1. "Fortelizin".
2. "Zaltrap".
3. "Eilea".

To su uglavnom antitumorski lijekovi, ali postoje i druga područja liječenja povezana s ovom aktivnom tvari.

Prema novoj studiji objavljenoj u naučnom časopisu Nature Communications, nova vakcina, takođe nazvana LASSARAB, dizajnirana da zaštiti ljude i od Lassa groznice i od bjesnila, pokazala je obećavajuće rezultate u pretkliničkim studijama. Kandidat za inaktiviranu rekombinantnu vakcinu koristi oslabljeni virus bjesnoće.

Istraživački tim je ubacio genetski materijal Lassa virusa u vektor virusa bjesnoće tako da je vakcina eksprimirala površinske proteine i u Lassi i u ćelijama bjesnoće. Ova Površinska jedinjenja izazivaju imuni odgovor na infektivne agense. Tada je takva vakcina inaktivirana da "uništi" korišteni živi virus bjesnoće za izradu nosača.

Metode dobijanja

Postoji nekoliko sistema proizvodnje supstanci. Opšta metoda dobijanja rekombinantnog proteina zasniva se na dobijanju biološkog materijala iz sinteze. Ali postoje i drugi načini.

Trenutno postoji pet glavnih sistema ekspresije:

1. Sistem ekspresije E. Coli.
2. Sistem ekspresije kvasca.
3. Sistem ekspresije ćelija insekata.
4. Sistem ekspresije ćelija sisara.
5. Sistem ekspresije proteina bez ćelija.

Posljednja opcija je posebno pogodna za ekspresiju transmembranskih proteina i toksičnih spojeva. Poslednjih godina, supstance koje je teško izraziti konvencionalnim intracelularnim metodama uspešno su integrisane u ćelije in vitro. U Bjelorusiji se široko koristi proizvodnja rekombinantnih proteina. Postoji niz državnih preduzeća koja se bave ovim pitanjem.

Sistem sinteze proteina bez ćelija je brza i efikasna metoda sinteze ciljnih supstanci dodavanjem različitih supstrata i energetskih kompozicija neophodnih za transkripciju i translaciju u enzimskom sistemu ćelijskih ekstrakata. Posljednjih godina prednosti metoda bez ćelija takvih vrsta tvari, kao kompleks su postepeno pojavili, toksična membrana, koja pokazuje njihovu potencijalnu primjenu u biofarmaceutskom polju.

Tehnologija bez ćelija može lako i kontrolirano dodati razne aminokiseline koje se ne pojavljuju prirodno kako bi se postigli složeni procesi modifikacije koje je teško riješiti nakon konvencionalne rekombinantne ekspresije. Takve metode imaju visoku vrijednost primjene i potencijal za isporuku lijekova i razvoj vakcine korištenjem čestica sličnih virusu. Veliki broj membranskih proteina uspješno je izražen u slobodnim ćelijama.

Ekspresija jedinjenja

Rekombinantni protein CFP10-ESAT 6 se proizvodi i koristi za stvaranje vakcina. Takav tuberkulozni alergen vam omogućava da ojačate imuni sistem i razvijete antitela. Općenito, molekularno istraživanje uključuje proučavanje bilo kojeg aspekta proteina, kao što su struktura, funkcija, modifikacije, lokalizacija ili interakcije. Da bi istražili kako specifične supstance regulišu unutrašnje procese, istraživačima su obično potrebna sredstva za proizvodnju funkcionalnih jedinjenja od interesa i koristi.

S obzirom na veličinu i složenost proteina, hemijska sinteza nije održiva opcija za ovaj poduhvat. Umjesto toga, žive ćelije i njihovi ćelijski mehanizmi se obično koriste kao fabrike za stvaranje i konstruisanje supstanci na osnovu datih genetskih šablona. Sistem ekspresije rekombinantnih proteina dalje razvija potrebnu strukturu za stvaranje lijeka. Zatim, izbor potrebnih materijal za postoje različite kategorije lijekova.

Za razliku od proteina, DNK je lako konstruisati sintetički ili in vitro, koristeći dobro dokazane rekombinantne metode. Shodno tome, DNK matrice specifičnih gena, sa ili bez dodanih reporterskih sekvenci ili sekvenci oznaka afiniteta, mogu se konstruisati kao matrice za ekspresiju supstance koja se ispituje. Takve kompozicije dobijene iz takvih matrica DNK nazivaju se rekombinantni proteini.

Tradicionalne strategije ekspresije supstance uključuju transfekciju ćelija pomoću DNK vektora koji sadrži matriks i naknadnu kultivaciju ćelija tako da transkribuju i prevode željeni protein. Tipično, ćelije se zatim liziraju kako bi se izvukao izraženi sastav za naknadno prečišćavanje. Rekombinantni protein CFP10-ESAT6 se obrađuje na ovaj način i prolazi sistem prečišćavanja od mogućeg stvaranja toksina. Tek nakon toga ulazi u vakcinu za sintezu.

Prokariotski i eukariotski in vivo sistemi ekspresije molekularnih supstanci se široko koriste. Izbor sistema zavisi od vrste proteina, zahteva za funkcionalnom aktivnošću i željenog prinosa. Ovi sistemi ekspresije uključuju sisare, insekte, kvasac, bakterije, alge i ćelije. Svaki sistem ima svoje prednosti i probleme, a odabir pravog sistema za određenu primjenu važan je za uspješno izražavanje supstance pregledane u članku.

Izraz sisara

Upotreba rekombinantnih proteina omogućava razvoj vakcina i lijekova različitih nivoa. Za to se može koristiti ova metoda dobijanja supstance. Sistemi ekspresije sisara mogu se koristiti za proizvodnju proteina iz životinjskog svijeta koji imaju najrodniju strukturu i aktivnost zbog svog fiziološki relevantnog okruženja. To dovodi do visokog nivoa posttranslacijske obrade i funkcionalne aktivnosti. Sistemi ekspresije sisara mogu se koristiti za proizvodnju antitijela, složenih proteina i spojeva za upotrebu u funkcionalnim testovima zasnovanim na ćelijama. Međutim, ove prednosti su kombinovane sa težim kulturnim uslovima.

Sistemi ekspresije sisara mogu se koristiti za proizvodnju proteina privremeno ili kroz stabilne ćelijske linije gdje je konstrukcija ekspresije integrirana u genom domaćina. Iako se takvi sistemi mogu koristiti u nekoliko eksperimenata, privremena proizvodnja može stvoriti veliku količinu tvari za jednu do dvije sedmice. Biotehnologija rekombinantnih proteina ovog tipa je veoma tražena.

Ovi prolazni, visoko produktivni sistemi ekspresije sisara koriste suspenzijske kulture i mogu dati grame po litru. Osim toga, ovi proteini imaju više nativnih sklopivih i posttranslacijskih modifikacija, kao što je glikozilacija, u poređenju sa ostalo sistemi ekspresije.

Izraz od insekata

Metode proizvodnje rekombinantnih proteina nisu ograničene samo na sisare. Postoje i produktivniji načini u pogledu troškova proizvodnje, iako je prinos supstance na 1 litar tretirane tečnosti mnogo niži.

Ćelije insekata mogu se koristiti za ekspresiju proteina visokog nivoa sa modifikacijama sličnim sistemima sisara. Postoji nekoliko sistema koji se mogu koristiti za proizvodnju rekombinantnog bakulovirusa, koji se zatim može koristiti za ekstrakciju supstance od interesa u ćelijama insekata.

Ekspresija rekombinantnih proteina može se lako proširiti i prilagoditi kulturi suspenzije visoke gustine za veliku proizvodnju molekula jedinjenja. Funkcionalnije su slični izvornom sastavu materije sisara. Iako prinos može biti do 500 mg / l, proizvodnja rekombinantnog bakulovirusa može potrajati dugo, a uslovi uzgoja su složeniji od prokariotskih sistema. Međutim, u južnijim i toplijim zemljama ova metoda se smatra efikasnijom.

Bakterijski izraz

Proizvodnja rekombinantnih proteina takođe se može uspostaviti uz pomoć bakterija. Ova tehnologija se mnogo razlikuje od gore opisanih. Sistemi ekspresije bakterijskih proteina su popularni jer se bakterije lako uzgajaju, brzo rastu i daju visoke prinose rekombinantnog sastava. Međutim, eukariotske tvari s više domena izražene u bakterijama često su nefunkcionalne jer stanice nisu opremljene za obavljanje potrebnih posttranslacijskih modifikacija ili molekularno preklapanje.

Pored toga, mnogi proteini postaju nerastvorljivi u obliku molekula za uključivanje, to su veoma teško se oporavlja bez rigidnih denaturatora i kasnijih glomaznih postupaka ponovnog oblikovanja molekularnog sastava. Uglavnom se ova metoda i dalje smatra uglavnom eksperimentalnom.

Izraz bez ćelija

Rekombinantni protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu stafilokinaze dobija se na malo drugačiji način. Deo je mnogih vrsta injekcija, za koje je potrebno nekoliko sistema pre upotrebe.

Ekspresija proteina bez ćelija je sinteza supstance in vitro koristeći ekstrakte celih ćelija kompatibilne sa translacijom. U principu, ekstrakti cijelih ćelija sadrže sve makromolekule i komponente, neophodno za transkripcija, prijevod, pa čak i posttranslacijska modifikacija.

Ove komponente uključuju RNK polimerazu, regulatorne proteinske faktore, oblike transkripcije, ribosome i trna. Uz dodatak kofaktora, nukleotida i specifičnog genskog matriksa, ovi ekstrakti mogu sintetizirati proteine od interesa za nekoliko sati.

Iako nisu održivi za veliku proizvodnju, sistemi ekspresije proteina bez ćelija ili in vitro proteina (IVT) imaju niz prednosti u odnosu na tradicionalne in vivo sisteme.

Ekspresija bez ćelija omogućava brzu sintezu rekombinantnih jedinjenja bez učešća ćelijske kulture. Sistemi bez ćelija omogućavaju označavanje proteina modifikovanim aminokiselinama, kao i ekspresione spojeve koji prolaze kroz brzu proteolitičku razgradnju unutarćelijskim proteazama. Osim toga, koristeći metodu bez ćelija, lakše je istovremeno eksprimirati mnogo različitih proteina (na primjer, testirati mutacije proteina ekspresijom u malom obimu iz mnogih različitih matrica rekombinantne DNK). U ovom reprezentativnom eksperimentu korišten je IVT sistem za ekspresiju proteina kaspaze - 3 kod ljudi.

Zaključci i perspektive za budućnost

Proizvodnja rekombinantnih proteina sada se može smatrati zrelom disciplinom. To je rezultat brojnih inkrementalnih poboljšanja u čišćenju i analizi. Trenutno programi za otkrivanje lijekova rijetko prestaju zbog nemogućnosti proizvodnje ciljnog proteina. Paralelni procesi za ekspresiju, prečišćavanje i analizu nekoliko rekombinantnih supstanci danas su dobro poznati u mnogim laboratorijama širom svijeta.

Proteinski kompleksi i rastući uspjeh u stvaranju topljivih membranskih struktura zahtijevat će više promjena kako bi se održala potražnja. Pojava efikasnih ugovornih istraživačkih organizacija za redovniju opskrbu proteinima omogućit će preraspodjelu naučnih resursa za rješavanje ovih novih problema.

Pored toga, paralelni tokovi rada treba da omoguće stvaranje kompletnih biblioteka supstance koja se razmatra kako bi se omogućila identifikacija novih ciljeva i poboljšani skrining, zajedno sa tradicionalnim projektima detekcije lekova malih molekula.