Citofluorimetrija protoka - suština i primjena

Citofluorimetrija toka je citološka metoda istraživanja, koristi se za dubinsku analizu ćelija. Njegova prednost je što vam omogućava proučavanje svake ćelije zasebno. Ova vrsta analize pomaže u procjeni nekoliko parametara u stotinama ćelija u nekoliko sekundi. Zbog toga se citofluorimetrija smatra jednom od najbržih i najtačnijih metoda analize koja je trenutno dostupna naučnicima i kliničarima.

Princip

Princip metode citofluorimetrije protoka zasnovan je na merenju rasipanja svetlosti i luminescencije (fluorescencije) ćelija. Suspenzija ćelije se prenosi u obliku toka velikom brzinom kroz ćeliju citometra, gdje se ozračuje laserom. Tu se izvodi i takozvano hidrodinamičko fokusiranje. Njegov mehanizam sastoji se u činjenici da protok iz ćelije sa proučavanim česticama na izlazu teče u spoljni mlaz, koji ima veću brzinu. Kao rezultat toga, čestice su raspoređene u uređen lanac.

Ćelije su unaprijed označene posebnim fluorescentnim bojama (fluorohromi). Zahvaljujući njima, laserski snop uzbuđuje sekundarni sjaj. Primljene svjetlosne signale bilježe detektori. Nakon toga, informacije se obrađuju pomoću softverskih algoritama koji vam omogućavaju brojanje pojedinačnih ćelijskih populacija koje se razlikuju po bilo kojim kriterijima.

Ispitivanje tradicionalnom mikroskopijom često vam ne dozvoljava razlikovanje različitih ćelija, jer izgledaju isto. Citofluorimetrija može pružiti druge podatke (integritet strukture DNK), analizirati ekspresiju proteina, preživljavanje ćelija.

Budući da su za pobuđivanje fluorohroma potrebne svjetlosne zrake različitih talasnih dužina, kao i različite vrste detektora, moderne instalacije opremljene su s nekoliko kanala za otkrivanje (od 4 do 30). Broj laserskih emitera može biti od 1 do 7. Kompleksniji uređaji omogućavaju multiparametrijsko proučavanje nekoliko svojstava čestica odjednom.

Prednosti i mane

Prednosti citofluorimetrije protoka uključuju sljedeće:

• velika brzina obrade (Registracija do 30 hiljada događaja u 1 sekundi);
• mogućnost proučavanja velikog broja ćelija (do 100 miliona. u uzorku);
• kvantitativna procjena intenziteta fluorescentnog zračenja;
• analiza svake od ćelija;
• istovremeno istraživanje heterogenih procesa;
• automatsko odvajanje podataka po populacijama ćelija;
• visokokvalitetna vizualizacija rezultata.

Još jedna karakteristika ove tehnologije je da se analizirana čestica može obojiti sa nekoliko fluorescentnih rastvora. Zahvaljujući tome, odvija se multiparametrijska studija.

Nedostaci uključuju složenost tehničke opreme i potrebu za posebnom pripremom uzorka.

Unit-format

Prvi uređaji ovog tipa pojavili su se već 1968. godine u Njemačkoj, ali su postali široko rasprostranjeni mnogo kasnije. Trenutno se svi uređaji koji rade metodom citofluorometrije protoka mogu podijeliti u 2 vrste:

• uređaja koji meri fluorescentno zračenje (dve ili više talasnih dužina), svetlosno rasipanje pod uglom od 10 i 90 ° (mali ugao i bočni detektor rasipanja);
• su uređaji koji, pored merenja nekoliko ćelijskih parametara, automatski sortiraju u grupe u skladu sa ovim kriterijumima.

Direktni detektor rasipanja svjetlosti dizajniran je za određivanje veličine ćelije, a uređaj za registraciju lateralnog rasijanja svjetlosti omogućava vam da dobijete informacije o prisutnosti unutarćelijskih granula, omjeru volumena citoplazme i jezgre.

Klasični citometri, za razliku od svetlosnih mikroskopa, ne dozvoljavaju dobijanje slike ćelije. Međutim, poslednjih godina razvijeni su kombinovani uređaji koji su u stanju da kombinuju mogućnosti mikroskopa i citofluorimetra. O njima ćemo govoriti u nastavku.

Citometri za slike

Jedna karakteristika karakteristična je za uređaje koji se koriste u klasičnoj citofluorometriji protoka: ako su rijetki događaji registrovani u populaciji analiziranih ćelija, onda ne postoji način da se proceni koja je njihova suština. Ove čestice mogu se pokazati kao ostaci mrtvih ćelija ili Rijetka grupa njih. U konvencionalnim uređajima takvi su podaci isključeni iz općeg toka događaja, ali mogu biti od posebne vrijednosti za naučnu i kliničku analizu.

Vizualizirajući protočni citometri nove generacije omogućavaju vam snimanje slike svake ćelije koja prolazi u protoku kroz zonu detektora. Lako ga je vidjeti klikom na odgovarajuće područje dijagrama koje se prikazuje na monitoru računara.

Područja primjene

Citofluorometrija toka je univerzalna metoda, koji se koristi u mnogim oblastima medicine i nauke:

• imunologija;
• onkologije;
• transplantologija (transplantacija crvene koštane srži, matične ćelije);
• Hematologija;
• toksikologija;
• biohemija (merenje kiselosti unutar ćelije, proučavanje drugih parametara);
• farmakologija (stvaranje novih lijekova);
• mikrobiologija;
• parazitologija i virusologija;
• oceanologija (proučavanje fitoplanktona za procjenu stanja rezervoara i drugih zadataka);
• nanotehnologija i analiza mikročestica.

Imunologija

Ljudski imuni sistem sastoji se od velikog broja različitih ćelija. Citofluorimetrija protoka u imunologiji omogućava procjenu njihove strukture i funkcija, odnosno provođenje morfofunkcionalne analize.

Takve studije pomažu u proučavanju složene prirode imuniteta. Ćelijski fenotipi se mijenjaju kao rezultat aktivacije antigenima, razvoja patologija i drugih faktora. Citofluorimetrija može odvojiti subpopulacije imunih ćelija u složenoj mešavini i proceniti sve njihove promene u dinamici.

Onkologije

Jedan od najvažnijih zadataka u onkologiji je diferencijacija ćelija prema njihovom tipu. Princip analize metodom protočne citofluorimetrije u onkohematologiji temelji se na sljedećem fenomenu: prilikom obrade uzorka posebnom fluorescentnom bojom veže se za citoplazmatske proteine. Nakon podjele u aktivno proliferirajućim ćelijama, njegov sadržaj se smanjuje za pola. Shodno tome, intenzitet sjaja ćelija smanjuje se dvostruko.

Postoje i drugi načini za otkrivanje proliferirajućih ćelija:

• upotreba DNK-vezujućih boja (propidij jodid);
• primjena označenog uracila;
• Registracija povećanog nivoa ekspresije ciklinskih proteina koji su uključeni u regulaciju ćelijskog ciklusa.